微生物檢驗培養(yǎng)基制備有多少步驟？每步應怎么操作？今天中海生物技術(shù)zhzbio.com為大家解析微生物檢驗培養(yǎng)基制備的九個步驟關(guān)注要點。

步驟一：稱取數(shù)量

用1/100的電子天平稱出培養(yǎng)基所需的藥物。首先參照配方計算出配制相應培養(yǎng)基需要各成分的數(shù)量，然后用電子天平準確稱取重量（將稱量紙折疊成簸箕盛藥）。 

步驟二：培養(yǎng)基溶化

將中海培養(yǎng)基納入燒杯容器中，加小適量的水，緩慢加水并用玻璃棒小幅度攪拌。倘若培養(yǎng)基中不含瓊脂，則不需要對培養(yǎng)基加熱；相反含有瓊脂，就需要用本生燈/電磁爐加熱煮沸。待培養(yǎng)基完全溶解后再加入適量的水攪拌均勻。如準備的北京中海培養(yǎng)基較多，在不銹鋼鍋中融化加熱，可以用溫水加熱，需不停攪拌，防止焦化。如果不小心出現(xiàn)焦化現(xiàn)象，則制備好的培養(yǎng)基將無法使用，必須重新配制中海生物培養(yǎng)基。

不要使用銅或鐵容器溶解制備培養(yǎng)基，因為銅或鐵容器可能會導致容器內(nèi)培養(yǎng)基中銅、鐵超標，影響實驗結(jié)果，其中培養(yǎng)基中銅含量大于0.3毫克每升，細菌不適宜生長。 

鐵含量超過0.14毫克每升，防止細菌產(chǎn)生毒素。容易發(fā)生反應和沉淀的藥物應單獨溶解，然后加入培養(yǎng)基中，如磷酸氫二鉀和硫酸鎂。

步驟三：調(diào)培養(yǎng)基pH

雖然中海培養(yǎng)基中含有緩沖物質(zhì)，可以盡量使培養(yǎng)基的pH值保持在標準范圍內(nèi)，但如果配制的培養(yǎng)基不能要求，則必須進行必要的調(diào)整。如果您有校準過的 pH 計，則可以使用 pH 計。如果沒有，可以使用精確的pH試紙，然后根據(jù)需要使用1 mol/L氫氧化鈉或1 mol/L鹽酸進行微調(diào)。使用 0.1 氫氧化鈉或 0.1 mol/L 鹽酸進行調(diào)整至所需的pH值。

培養(yǎng)基有酸性或堿性，pH值一般為7.4～7.6。對于需要用氫氧化鈉高壓滅菌的介質(zhì)，將pH調(diào)至比要求值高0.1～0.2個單位，因為用氫氧化鈉調(diào)節(jié)時，高壓滅菌后介質(zhì)的pH值要降低0.1 ~0.2。如果微生物培養(yǎng)基中含有碳酸鈣，則無需調(diào)整pH值。

步驟四：培養(yǎng)基過濾

如果對配制的培養(yǎng)基沒有特殊要求，這一步可以省略。中'海培養(yǎng)基如有渾濁和沉淀現(xiàn)象，可將需要澄清的液體培養(yǎng)基用油紙過濾。固體介質(zhì)可以用雙層紗布過濾，中間有一層薄薄的脫脂棉。 如果過濾法不能滿足澄清要求，可以采用蛋清澄清法，即將培養(yǎng)基加熱冷卻至五十度至六十度，不超過三角瓶一半的容量。每一千毫升放入1~2個蛋清，用力搖晃三至五分鐘，用121℃高壓蒸汽滅菌二十分鐘，趁熱取出過濾。

步驟五：培養(yǎng)基分裝

準備好的中.海培養(yǎng)基根據(jù)用途不同分為燒瓶、試管等容器，分裝試管量大采用自動分液器，分裝試管量小，可以用漏斗分液。分液量不超過容器體積的三分之二。三角瓶不要超過體積的二分之一；瓊脂斜面不要超過試管長度的五分之一。滅菌后斜面應為培養(yǎng)基量的三分之一，底層應為培養(yǎng)基量的三分之二；半固態(tài)瓊脂的體積為三分之一；

用于接種或保護細菌的高級瓊脂，分裝試管長度的三分之一和四分之一，接種厭氧菌的量應達到三分之二；瓊脂平板90毫米內(nèi)徑13~15毫升，內(nèi)徑70毫米8~10毫升。如果瓊脂平板表面較水，可將平板倒置，置于37℃培養(yǎng)箱中三十分鐘，晾干后使用。每批培養(yǎng)基分裝在二十毫升左右的小玻璃瓶中，與該批培養(yǎng)基同時滅菌，在以確定這批培養(yǎng)基的最終pH值。

步驟六：培養(yǎng)基滅菌處理

分裝完成的培養(yǎng)基應馬上滅菌。其殺毒滅菌方式主要有三種類型：

⑴高壓蒸汽滅菌方式

此方法可用于大多數(shù)耐熱培養(yǎng)基。對于小份：使用 121°C 十五分鐘；大份：121°C 三十分鐘；對于含碳水化合物的中.海培養(yǎng)基，僅需 113~115°C 十五分鐘。滅菌以避免糖分的破壞。

⑵煮沸滅菌法方式

此方法可用于含有不耐高溫物質(zhì)的培養(yǎng)基。

⑶過濾除菌方式

過濾除菌，采用無菌技術(shù)定量添加培養(yǎng)基。血液和抗生素可以用無菌技術(shù)抽取并加入冷卻至約五十度的培養(yǎng)基中。當中'海培養(yǎng)基中含有不耐熱物質(zhì)時可以使用此方法。

對LST培養(yǎng)基進行滅菌時，發(fā)酵管內(nèi)可能存在氣泡。為了防止發(fā)酵管內(nèi)形成氣泡，可以采取以下措施：

⑴倒置的小管充滿培養(yǎng)基，不留氣泡，然后加入含有 LST 的試管中。

⑵在關(guān)閉殺菌鍋的排氣閥之前，將鍋內(nèi)的氣體排空。

⑶試管塞不要塞得太緊。使用硅膠塞時，請勿使用橡膠塞。

⑷不可過早打開殺菌鍋，等殺菌鍋內(nèi)的氣壓和溫度降到與室溫相同或相差不大時再打開殺菌鍋。

如果按照以上方法操作還有氣泡，可以用水作為培養(yǎng)基組的對照試驗。如果培養(yǎng)基組有氣泡，對照組沒有氣泡，可以確定培養(yǎng)基本身原因。

步驟七：培養(yǎng)基倒入平板

將滅菌溶化的培養(yǎng)基冷卻至五十度后，倒入無菌干燥的培養(yǎng)皿中。微生物培養(yǎng)基制備的溫度不能太高，否則培養(yǎng)皿內(nèi)蓋容易形成過多的冷凝水；溫度太低，中 海培養(yǎng)基容易凝固成塊狀，不能做成平板。倒平板時，要靠近酒精的火焰以防止外來細菌落入盤中。左手托住培養(yǎng)皿，右手托住三角瓶底部。用小指和手掌拉出錐形瓶的棉塞，燒灼燒瓶口，用拇指和食指在培養(yǎng)皿蓋上打開一條縫，直到燒瓶口剛好伸手進去，倒入培養(yǎng)基，直到底部被覆蓋。不要超過培養(yǎng)皿高度的三分之一，迅速蓋上蓋子，放在桌子上，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基分布均勻，凝結(jié)后即可。

步驟八：培養(yǎng)基擺斜面

滅菌完成后，將試管中的中海瓊脂培養(yǎng)基放在木棒或玻璃棒上，同時它很熱，并且有適當?shù)钠露?。冷卻后使瓊脂凝固并變成斜面。斜面長度不超過試管的二分之一。

步驟九：微生物培養(yǎng)基質(zhì)檢

檢驗培養(yǎng)基滅菌后，發(fā)現(xiàn)有破損，浸水，顏色異常，棉塞被培養(yǎng)基污染。所有這些都必須丟棄，不能重復使用，并確定其最終pH值。 無菌檢查和效果檢查也是必需的。無菌檢查是取1~2瓶無菌培養(yǎng)基，37℃孵育一兩天，確認無細菌生長；效果檢查是將標準菌株接種到相關(guān)培養(yǎng)基上進行細菌檢查。 動物的生長、形態(tài)和生化條件與已知條件一致。兩個條件都合格，準備好的培養(yǎng)基就可以使用了。

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