本抗原系用雞傳染性支氣管炎病毒（M41株）接種SPF雞胚，收獲尿囊液，經(jīng)A型魏氏梭菌菌液活化制成。血凝效價不低于1:128，用于檢測雞傳染性支氣管炎的抗體；陽性血清系用M41株病毒接種SPF雞制備的免疫血清；陰性血清為SPF雞血清。

【用法與判定】

1  IB HA工作抗原的制備

1.1  IB HA 抗原效價測定

1.1.1  用移液器在96孔微量板上從第1孔至第12孔，依次加入30μl稀釋液。

1.1.2  取30μl IB HA抗原加入第1孔，依次作2倍系列稀釋至第11孔后棄去30μl稀釋液，各孔均應(yīng)混合均勻。

1.1.3  每孔加入1%雞紅細(xì)胞懸液30μl，再補加30μl稀釋液（保證與HI試驗同反應(yīng)體積），同時設(shè)立紅細(xì)胞懸液對照孔。

1.1.4  將96孔板至振蕩器上振蕩10s，置2~8℃作用45min～60min分鐘，判定結(jié)果。判定時，將微量板傾斜45°，30s內(nèi)觀察結(jié)果，對照孔紅細(xì)胞應(yīng)完全沉淀到孔底并呈淚珠樣流滴（不凝集—），HA陽性孔紅細(xì)胞應(yīng)均勻分布于孔內(nèi)（完全凝集#）或少量沉淀但不呈淚珠樣流滴（不完全凝集++），使紅細(xì)胞完全凝集的最大稀釋倍數(shù)判為該抗原的HA效價。

上表所示血凝抗原的血凝價為1:128。

1.2. 抗原工作液配制及檢驗

1.2.1  4個HA單位（4HAU）的工作抗原的配制：如果IB HA抗原的HA效價測定結(jié)果為1:128，則4個HA單位為128/4=32，將HA抗原用稀釋液稀釋32倍，即為4HA單位的工作抗原液。

1.2.2  回歸試驗：在96孔V型板中選取6列4行，每列均加入30μl PBS，第2列加入60μl PBS，第6列加入120ul PBS。在第1列前3行中加入稀釋好的4HAU 30μl（2倍稀釋），用移液器（排槍）反復(fù)吹打10次后，吸取30μl加入第3列（4倍稀釋），反復(fù)吹打10次后吸取30μl加入第5列（8倍稀釋），反復(fù)吹打10次后，棄去30μl。

在第2列前3行中加入稀釋好的4HAU 30μl（3倍稀釋），用移液器反復(fù)吹打10次后，棄去30μl，再吸取30μl加入第4列（6倍稀釋），反復(fù)吹打10次后，棄去30μl。在第6列前3行中加入稀釋好的4HAU 30μl（5倍稀釋），用移液器反復(fù)吹打10次后，棄去120μl，每孔加入30μl PBS，再加入30μl 1％紅細(xì)胞懸液，室溫靜置30min～45min，對照孔的紅細(xì)胞全部沉淀時，觀察判讀結(jié)果。

1.2.3  4單位抗原配制：根據(jù)回歸試驗結(jié)果，配制4HAU。例如回歸試驗結(jié)果為1:5，則將抗原稀釋40倍（假設(shè)抗原血凝效價為1:128，初步4單位抗原為1:32，根據(jù)回歸結(jié)果，抗原應(yīng)稀釋倍數(shù)為32×5÷4即可，也應(yīng)采用兩步稀釋法）。

2 血凝抑制試驗（HI）

2.1 血凝板每排檢測1份被檢血清，設(shè)陽性血清與陰性血清對照。

2.2 第1孔～第10孔，每孔加入30μl PBS，第11孔加入30μl（抗原對照孔），第12孔加入60μl（紅細(xì)胞對照孔）。

2.3 取待檢血清30μl加入第1孔中（懸空加入，槍頭棄去，更換新槍頭進(jìn)行稀釋），用移液器對待檢血清作倍比稀釋至第10孔：即將第1孔用移液器反復(fù)吹吸10次后，吸出30μl移至第2孔，再反復(fù)吹吸10次后，吸出30μl移至第3孔，依此類推至第5孔更換一次槍頭，繼續(xù)稀釋至第10孔，從第10孔中吸出30μl棄去，如表3。

2.4 第1～11孔，每孔加入4 HAU 30μl，輕微振蕩后置于2~8℃反應(yīng)30min。

2.5補加紅細(xì)胞及試驗結(jié)果判定：作用30min后將配制好的1%雞紅細(xì)胞加入各板中，30μl/孔，置于2~8℃作用，反應(yīng)30~45min（紅細(xì)胞對照完全沉淀時）讀取HI試驗結(jié)果，讀取完全中和孔的稀釋倍數(shù)（45°角傾斜板，10s內(nèi)紅細(xì)胞呈淚滴狀下滑，周圍液體清亮無混濁）做為判定結(jié)果。

上表所示待檢血清抑制價1:64。

【注意事項】

1. 試劑盒儲存于2~8℃，使用前不需要回溫，試驗結(jié)束后放回2~8℃保存

2. 試驗應(yīng)在室溫條件下進(jìn)行，每次檢測時應(yīng)設(shè)陽性、陰性血清（稀釋方法同被檢血清）及紅細(xì)胞對照。

3. 抗原工作液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，使用時必須充分搖勻。

4. 應(yīng)將使用劑量的抗原無菌吸出，剩余抗原及時放回冰箱保存。

5. 只用于檢測雞血清，不能用于雞全血反應(yīng)。

【規(guī)格】 抗原 1ml/瓶，1瓶；稀釋液 200ml/瓶，1瓶；陽性血清1ml瓶，1瓶；陰性血清1ml/瓶，1瓶。

【貯藏與有效期】 2～8℃保存，有效期為24個月。

【生產(chǎn)企業(yè)】 中海生物科技有限公司

僅在獸醫(yī)指導(dǎo)下使用

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