在elisa實驗操作步驟中最易出現(xiàn)的十個問題及處置解決方法

 

 

elisa實驗操作問題一：無顏色

 

①實驗試劑孵育的時長并沒有按產品說明采用。

 

核對生物素化抗體，聯(lián)接的hrp實驗試劑或鏈霉親和素-hrp采用的時長是不是合理。

 

②不同的試劑盒或不同的批號的實驗試劑混合使用。

 

從新查驗實驗試劑的標簽貼，保障全部組成部分都應屬正采用的試劑盒。不可以混合使用不同的試劑盒或不同的批號的實驗試劑。

 

③漏加酶

 

查驗操作步驟，特別注意不可以漏加。

 

④hrp酶影響了疊氮鈉

 

采用新制備的實驗試劑，禁含疊氮鈉

 

⑤標準品出現(xiàn)問題（若在樣本孔中有數(shù)據(jù)信號）

 

按中海產品說明查驗標準品的制備環(huán)節(jié)，采用一瓶新標準品

 

⑥某一器皿未清洗干凈,殘余滅活酶物質

 

盡量避免用試劑盒器皿，另外找務必干凈整潔、安全可靠的容器。

 

⑦采用含血清的緩沖液制備/復溶抗體

 

從新核對所采用的實驗試劑

 

⑧漏加顯色劑a或b

 

加顯色劑后仔細觀察孔中液位相對高度

 

⑨實驗試劑制備/采用有誤

 

將試驗重新做，嚴格規(guī)范按產品說明采用，每回制備和采用前看清楚標簽貼。

 

⑩緩沖液影響

 

制備新鮮的緩沖液

 

elisa實驗操作問題二：顯色弱

 

①超出有效期限的企業(yè)產品或許會出現(xiàn)比較弱的數(shù)據(jù)信號。

 

查驗中海生物技術產品的有效期限

 

②添加實驗試劑的大小和時長有誤

 

核對所采用的每一個實驗試劑的大小正確性和添加時間是合理。

 

③實驗試劑、試樣用前無法穩(wěn)定平衡

 

用前實驗試劑、試樣置室內溫度穩(wěn)定平衡十分鐘左右

 

④降低孵育時長能使試驗的數(shù)據(jù)信號變弱。

 

查驗孵育的時長。

 

⑤在溫度發(fā)生變化的區(qū)域環(huán)境內孵育酶標板。

 

核對孵育的溫度，應避免出現(xiàn)溫度的發(fā)生變化。

 

⑥采用了被影響的實驗試劑

 

查驗實驗試劑是不是被影響。

 

⑦標準品/樣本制備具體方法不標準規(guī)范

 

查驗標準品/樣本的制備，標準品應按產品說明做好復溶和稀釋。低溫貯存的樣本避免出現(xiàn)反復凍融，禁止采用溶血樣本。試樣用nan3防腐,抑制了酶的反應。

 

⑧顯色底物制備不標準規(guī)范

 

查驗底物的制備，如大小是不是正確性，混合是不是適當充足。

 

⑨檢測時間不合理

 

是不是在規(guī)定標準的時長內檢測。

 

⑩儀器設備設置有誤，濾色片不相匹配。

 

儀器設備是不是設置正確性，濾色片的選取是不是符合等。

 

elisa實驗操作問題三：過多的數(shù)據(jù)信號，所有的板子變成規(guī)則的藍色。

 

①不充分的的洗滌/洗滌流程被疏忽-沒融合的過氧化物酶仍有殘余。

 

最好是采用洗板機充分的洗滌，檢測孔內是不是有殘余的洗劑或加樣量是不是準確。

 

②底物溶液混合過早并轉成藍色

 

應操縱底物混合的時間并馬上采用。

 

③過多的酶結合物

 

檢測稀釋度，有必要時開展效價測定。

 

④封板膜或試劑器皿被多次重復使用，導致hrp殘余，使tmb底物出現(xiàn)非特異藍色。

 

采用新的封板膜，每一步采用不一樣的試劑器皿

 

⑤緩沖液中被污染金屬或hrp

 

制備最新緩沖液

 

elisa實驗操作問題四：高cv值，花板

 

①操作步驟不規(guī)范或洗滌不充分的

 

按產品說明書洗板/加樣/顯色，洗板極為重要。

 

②出現(xiàn)干板，并沒有采用封板膜、封板膜多次重復使用

 

確認每兩流程間，酶標板應維持濕潤。采用封板膜封口，特別注意每一步采用新的封板膜。

 

③因為錯誤操作或板子品質差、融合不勻稱導致包板不勻稱。

 

稀釋用的pbs中不必加其它蛋白，檢測包被和封閉液體積、時間和試劑添加的方法。檢測所采用的酶標板，采用elisa板，不必采用組織培養(yǎng)板。

 

④移液器不準確，吸頭多次重復使用。

 

檢測并校準移液器。每回取樣一定要換吸頭?？偨Y標本的添加流程，保障每回加樣的準確性，保證吸取的液體按所設定重量吸入和排出，持續(xù)加樣時特別注意檢測吸頭，保障所加液體的重量。

 

⑤樣品離心處置不全,反應孔內出現(xiàn)凝血或殘余細胞成份

 

標本充分在離心3000轉六分鐘以上，禁止采用凝血和溶血的標本

 

⑥緩沖液被污染

 

制備最新的緩沖液

 

elisa實驗操作問題五：標準曲線可獲得，但低或平的曲線兩點之間差別很大。

 

①酶結合物不夠

 

檢測稀釋度，有必要時開展效價測定。

 

②捕獲抗體并沒有很好融合到板上

 

檢測所采用的酶標板，采用elisa板，不必采用組織培養(yǎng)板，稀釋用的pbs中不必加其它蛋白。

 

③檢測抗體不夠

 

檢測稀釋度，有必要時開展效價測定

 

④板子顯色不夠

 

延長底物孵育實驗，采用中海生物品牌的底物溶液

 

⑤操作步驟不規(guī)范

 

總結elisa操作步驟，排除一切私自調整的程序流程。

 

⑥標準曲線稀釋度測算不正確

 

核查測算的具體情況，制備新的標準曲線

 

elisa實驗操作問題六：標準曲線非常好，只是沒有任何期許的陽性數(shù)據(jù)信號出現(xiàn)

 

①在樣本中無相對應的細胞因子

 

采用內參對照，反復實驗操作，慎重考慮實驗操作的相對應參數(shù)指標

 

②樣本基質遮掩檢測

 

將樣本起碼做1∶2相對應的稀釋，或開展全系列稀釋觀測它的恢復性

 

elisa實驗操作問題七：標準曲線非常好，只是樣本的判讀值很高。

 

①樣本中含的細胞因子水平超出檢測范疇

 

將樣本做稀釋并再度實驗操作

 

elisa實驗操作問題八：當選用辣根過氧化物酶(HRP)結合物時，TMB底物加終止液后顯示為綠色。

 

①孔中的試劑顯色不全面

 

輕輕地振蕩板子

 

elisa實驗操作問題九：邊緣效應

 

①工作中環(huán)境溫度不均衡化

 

防止將酶標板在變化溫度環(huán)境中孵育

 

elisa實驗操作問題十：漂移

 

①實驗操作操作過程中出現(xiàn)間斷

 

整體實驗操作應持續(xù)操作使用：在實驗操作進行前將全部標準品和樣本做合理的打算。

 

②試劑并沒有按產品說明書穩(wěn)定平衡至室內溫度

 

在全部試劑添加孔前，保障它們已穩(wěn)定平衡至室內溫度，否則中海產品說明書中有除此之外的特殊要求。

 

其他問題：

 

①是不是可更改檢測試劑盒所展示的實驗操作操作步驟？

 

通常情況下生產廠家為保障最大的靈敏度和特異性，對檢測試劑盒都開展了優(yōu)化，為保障每個檢測試劑盒實驗操作的規(guī)范化應按產品說明書操作使用。

 

②是不是可混用不一樣檢測試劑盒中的試劑？

 

不允許。其實是絕大部分試劑在每次檢測試劑盒中是特異性的，若有什么問題可與生產廠家或總經(jīng)銷商溝通。

 

③是不是可增多或減少樣本的重量。

 

商品性的檢測試劑盒所需添加的樣本重量是優(yōu)化的，應按產品說明書操作使用，不建議變更所加樣本的重量。

 

④是不是可重判定自身的標準曲線的點？

 

可以的。產品說明書上面有推薦的制備標準曲線時所需標準品的稀釋度，可更改稀釋倍數(shù)和增多曲線的點，只是務必在檢測范疇內，大于檢測試劑盒中最大標準品的點和小于靈敏度之下的點是不成功的。

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