中海羊大腸桿菌培養(yǎng)基制備六大步驟解析
日期:2021-07-23 | 中海生物技術(shù)文庫(kù) | 瀏覽:1125 次
本文是中海生物技術(shù)zhzbio.com羊大腸桿菌培養(yǎng)基制備六大步驟解析:
Ⅰ、凍存液的制備
將含有足夠菌量的液體培養(yǎng)基進(jìn)行離心后,沉淀過(guò)程中加入等量的40%甘油,置于-80°C冷凍。
Ⅱ、培養(yǎng)基制備
LB培養(yǎng)基配方:胰蛋白胨Trypton:10 克/升、酵母提取物YeastExtract:5 克/升、氯化鈉NaCl:10克/升、 pH7.4。
液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10克、酵母粉5克、氯化鈉 10克、水1000毫升、 pH7.4。
固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5%~2.0%瓊脂
Ⅲ、平板的制備
⒈稱(chēng)取10.0 g胰蛋白胨、5.0g酵母粉、10.0g氯化鈉,加800mL二次水溶解,用玻璃棒攪拌均勻,用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4左右,定容至1L,調(diào)節(jié)pH至7.4 如果溶液pH大于7.4,用1mol/LHCl調(diào)節(jié)。
⒉分裝到實(shí)驗(yàn)錐形瓶中。每瓶放入用量不宜過(guò)多,應(yīng)在瓶底下方二厘米左右。如果需要固體培養(yǎng)基,分裝后在液體培養(yǎng)基中加入約2%瓊脂,即150毫升中 海液體培養(yǎng)基中加入2.5g瓊脂。
⒊用塑料薄膜蓋住錐形瓶口依次將濾紙透氣孔和硬紙,用橡皮筋扎好。用記號(hào)筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱(chēng)和制備日期,所有錐形瓶的操作如上所述。
⒋中海使用121°C高壓滅菌15分鐘。
⒌取出滅菌培養(yǎng)基放置置于60℃電鼓風(fēng)干燥機(jī)中烘干,等錐形瓶封口紙干燥后取出。液體培養(yǎng)基可以直接儲(chǔ)存使用。因瓊脂培養(yǎng)基不會(huì)凝固。您可以通過(guò)紫外線(xiàn)消毒三十分鐘以上的無(wú)菌操作平臺(tái)上,把中'海培養(yǎng)基倒入在培養(yǎng)皿中約4mm厚度約10-15mL,直徑90mm,將培養(yǎng)皿堆疊在無(wú)菌操作臺(tái)上并放置約十分鐘。然后等瓊脂基本凝固后,就能涂抹到平板上了。
⒍如果平板不是即時(shí)使用,需把中海培養(yǎng)基滅菌后存放在錐形瓶中。當(dāng)需要平板制備時(shí),在微波爐中用中火檔位加熱約三分鐘易融化瓊脂,室溫環(huán)境冷卻二十分鐘確保不燙手再進(jìn)行制備平板。
Ⅳ、接種大腸桿菌
①取實(shí)驗(yàn)室保存的大腸桿菌BL21凍存液,用酒精燈灼燒管口,打開(kāi)離心管。
②接種方法1:用無(wú)菌移液器吸頭蘸取凍存液,在板邊緣畫(huà)一條橫線(xiàn),每三個(gè)車(chē)道為一組,將盤(pán)子旋轉(zhuǎn)一次,最后在中間畫(huà)一個(gè)鋸齒形;接種方法2:用吸管吸取100uL溶液放在平板上,用酒精燈消毒的厚涂片棒劃十字涂在平板上。
③因?yàn)閷?shí)驗(yàn)一般需要挑取單個(gè)菌落,涂抹平板的操作需考慮冷凍液中細(xì)菌的數(shù)量。若菌量過(guò)多,應(yīng)適當(dāng)稀釋。通常方法一更容易獲得單個(gè)菌落,涂抹平板應(yīng)靠近酒精燈操作。如果平板上涂有冷凍保存液,應(yīng)將其倒置以防止平板表面產(chǎn)生水蒸氣。
Ⅴ、羊大腸桿菌的培養(yǎng)
①將接種板倒置,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中。約十小時(shí)后菌落生長(zhǎng)。
②挑出生長(zhǎng)狀態(tài)良好、特征明顯的單菌落,接種于新鮮滅菌的中.海LB液體培養(yǎng)基中,220轉(zhuǎn)/分+37℃恒溫振蕩培養(yǎng)9~12小時(shí)。菌落呈乳白色和圓形特征,菌落邊緣整齊,表面光滑,表面顏色與背面顏色一樣。
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